Nach einem kurzen actionreichen und amüsanten Prolog, der im Jahr 1912 spielt und die Ursprungsgeschichte von Indiana Jones (hier gespielt von River Phoenix) quasi im Schnelldurchlauf zeigt, springt die Handlung ins Jahr 1938. Hier wird der erwachsene Archäologe nach einem äußerst feuchten Abenteuer von dem reichen Industriellen Walter Donavan (Julian Glover) beauftragt, den Heiligen Gral zu finden.
Hierbei handelt es sich um den Becher, aus dem Jesus Christus beim letzten Abendmal getrunken haben soll. Der Gral soll der- oder demjenigen, die oder der aus ihm trinkt, ewiges Leben verleihen. Die Suche nach dem Kelch gestaltet sich jedoch äußerst gefährlich und Indys Vater, der Gral-Experte Henry Jones Sr. (Sean Connery), ist mittlerweile spurlos verschwunden. Gemeinsam mit einer österreichischen Kollegin Elsa Schneider (Alison Doody), seinem Vorgesetzten an der Universität Marcus Brody (Denholm Elliott) und seinem alten Freund Sallah (John Rhys-Davies) versucht Indiana, zunächst seinen Vater und anschließend den Gral zu finden. Die Jagd wird erschwert, weil wieder einmal eine Gruppe von Nazis dasselbe Ziel verfolgt und sich ein oder mehrere Verräter unter Indianas Freunden befindet.
Der dritte Film der Indiana Jones Reihe wirkt in gewisser Hinsicht wie ein Abschlussfilm, der nicht nur auf die Jugend des Helden, sondern auch auf seine alternde Seite blickt, eine schwierige Vater-Sohn-Beziehung und sogar die Sterblichkeit des Helden verhandelt. Dabei werden auch jede Menge amüsante Details über die Jugend von Indiana Jones zutage gefördert, z. B. der Ursprung seines Spitznamens. Das Zusammenspiel zwischen Harrison Ford und Sean Connery funktioniert super, kurios ist allerdings das Connery im wahren Leben nur 12 Jahre älter war als sein Film-Sohn ist. Insgesamt ist der Blockbuster ein Riesenspaß und hat eine spektakuläre Actionsequenz mit einem Panzer in einer Wüste zu bieten. Es hätte tatsächlich als würdiger Abschluss der Reihe funktioniert, aber die Fans verlangten mehr und Hollywood entschied anders.